论文题目：基于PCR和巢式PCR技术的玉米南方锈病早期检测

发表期刊：中国农业科学

作者：马红霞（第1），石洁（通讯作者）

作者所在部门：玉米病虫害综合防治研究室

内容简介：

建立巢式PCR方法，快速检测处于病害潜育期的玉米叶片内的多堆柄锈菌（Puccinia polysora)，为玉米南方锈病（southern corn rust)的预测和防治提供技术支持。根据多堆柄锈菌ITS区序列，在其变异区设计3条多堆柄锈菌特异性检测引物NX471-F,NX255-F和NX255-R,建立以NX471-F与真菌ITS区通用引物ITS4为外侧引物，NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR。采用20 uL扩增体系：Ex Taq DNA聚合酶（5U.uL-¹) 0.15 uL,10×Ex Taq Buffer (Mg²⁺plus) 2 uL,dNTP Mixture (各2.5 mmol^-L) 1.6 uL,上下游引物（10 umo.L^-1)各0.3 uL,DNA 1 uL,14.65 uL ddH₂0。扩增程序：利用外侧引物NX471-F/ITS4进行第一步PCR扩增，95℃预变性7 min;95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环；72℃再延伸7 min。将扩增后的产物稀释20倍，取1 μL用作第二步PCR的扩增模板，然后以内侧引物NX255-F/NX255-R进行第二步PCR扩增，95℃预变性7 min;95℃变性30 s,66℃退火30 s,72℃延伸26 s,30个循环；72℃再延伸7 min。同时选用内侧引物进行常规PCR扩增，扩增体系同巢式PCR，扩增程序除循环数为38，其余程序同巢式PCR的第二步PCR检测。在此条件下对多堆柄锈菌、高粱柄锈菌（Puccinia sorghi）、青杨叶锈病菌（Melampsora laricipopulina)和7种玉米常见病原菌进行特异性检测，对不同梯度多堆柄锈菌基因组DNA和3种人工接种病叶进行灵敏度检测。巢式PCR检测体系仅在检测多堆柄锈菌时，产生了255bp的目的条带，其他菌株均未扩增出目的条带。巢式PCR检测体系对多堆柄锈基因组DNA的最低检测限为10 fg uL^-1，是常规PCR检测体系灵敏度的500倍。当1 g人工接种病叶含500-2.5×10⁴个多堆柄锈菌夏孢子时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别0和85.71%，巢式PCR可检测出的夏孢子个数最少为1000个；当1 g人工接种病叶中含1一7个夏孢子堆时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别76.19%和100%，常规PCR可检测出的夏孢子堆个数最少为2个，巢式PCR可检测出1个及以上夏孢子堆；当1 g人工接种病叶中含1一7个侵染点时，常规PCR和巢式PCR检出阳性率分别14.29%和66.67%，检测出的侵染点个数最少分别为6个和3个。成功建立了一种以NX471-F/ITS4为外侧引物，NX255-F/NX255-R为内侧引物的巢式PCR检测方法，可快速、高效、准确检测玉米叶片中潜伏期的多堆柄锈菌。